新冠病毒為何更易傳染？冷凍電鏡圖解病毒進入細胞的“鑰匙”

　　新冠病毒的傳染性為何更強?科學家用“火眼金睛”的冷凍電鏡技術，終于找到了其背后的原因——新冠病毒的關鍵刺突蛋白(S蛋白)與人體細胞的受體蛋白的親和力，要遠高于SARS-CoV。

　　病毒要進入人體細胞，必須找到人體細胞上相應的受體蛋白，而每個受體好比是一把“鎖”，得有相應的“鑰匙”才能打開，而后進入細胞內部。新冠病毒的“鑰匙”就是S蛋白。

　　新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，新冠病毒與宿主細胞作用的關鍵刺突蛋白(S蛋白，Spike glycoprotein)備受各研究團隊的重視。當地時間2月15日，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)疫苗研究中心與得克薩斯大學奧斯汀分校分子生物科學學院合作在生命科學預印本平臺bioRxiv發(fā)表文章“Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation”(論文未經同行評議)，對新型冠狀病毒的S蛋白進行了近原子結構分析。

　　根據已經公開的基因組序列，研究團隊合成并純化了新型冠狀病毒S蛋白的膜外部分。隨后用冷凍電鏡獲得純化S蛋白的3207張照片，經過3D重建，最終獲得分辨率為3.5 的S蛋白三聚體結構。

　　通過與SARS病毒的結構比較，研究團隊認為，新冠病毒的S蛋白結合人體ACE2(宿主細胞受體血管緊張素轉化酶2)的親和力要遠高于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的S蛋白

　　，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強得多。

　　研究團隊還測試了幾種已發(fā)布的SARS病毒RBD特異性單克隆抗體，發(fā)現它們與新冠病毒的S蛋白沒有明顯的結合，這表明兩種病毒RBD之間的抗體交叉反應性可能受到限制。

　　該論文的通訊作者為得克薩斯大學奧斯汀分校分子生物科學學院副教授Jason S. McLellan。McLellan是研究病毒的專家，此前在中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和埃博拉等病毒的結構方面做了很多非常重要的工作，包括利用冷凍電鏡、X光結晶學等技術分析冠狀肺炎病毒。

　　值得一提的是，這項研究首次提出新冠病毒S蛋白結合ACE2的親和力要遠高于SARS-CoV的S蛋白。早在1月21日和1月23日，中科院上海巴斯德研究所研究員郝沛等人、中科院武漢病毒所研究院石正麗等人均發(fā)表論文提到，

　　新型冠狀病毒和SARS病毒一樣，也是通過利用S蛋白結合人體ACE2蛋白進入細胞。不過，病毒與宿主細胞作用的關鍵S蛋白有更大的差異性。

　　郝沛等人還利用分子結構模擬的計算方法，評估了新型冠狀病毒和SARS病毒的S蛋白與人類ACE2分子相互作用的能力。結果發(fā)現，雖然新型冠狀病毒的S蛋白與ACE2之間的作用力低于SARS病毒，但是仍然非常強大。“盡管新型冠狀病毒的新結構與ACE2蛋白互作能力，由于丟失的少數氫鍵有所下降(相比SARS病毒S-蛋白與ACE2的作用有下降)，但仍然達到很強的結合自由能(-50.6 kcal/mol)。”

　　而與之相關的病毒傳染力目前也有眾多團隊給出數據。近日迄今為止最大規(guī)模新冠肺炎臨床數據的分析認為，衡量疾病傳染能力強弱的基本傳染數R0約為3.77，即在沒有防護措施的情況下每例患者平均會傳染給另外3.77人，同時強于SARS病毒的R0(2.9-3.324)。這也是迄今為止研究團隊得出的新冠病毒的最高R0值。

　　值得一提的是，此番破解工作使用了斬獲2017年諾貝爾化學獎的“冷凍電鏡”。

　　冷凍電子顯微鏡，就是應用冷凍固定術，在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，讓研究者能將生物分子“凍起來”，前所未有地觀察分析運動過程。這一表征對于生命化學的理解和藥物學的發(fā)展都有決定性影響，使得生物化學進入一個新的時代。

　　新冠病毒如何入侵人體

　　研究團隊發(fā)現，新型冠狀病毒利用高度糖基化的同源三聚體S蛋白進入宿主細胞。S蛋白經歷很多種結構重新排列后將病毒融合進入宿主細胞的細胞膜。這一過程包括病毒的S1亞基結合到宿主細胞受體上，引發(fā)三聚體不穩(wěn)定性的發(fā)生，進而造成S1亞基脫落S2亞基形成高度穩(wěn)定的融合后結構。

　　為了接近宿主細胞受體，S1亞基中的受體結合結構域(RBD)會經歷類似鉸鏈的構象移動從而隱藏或者暴露受體結合的關鍵位點。在這一過程中S1存在兩種狀態(tài)：“向下(down)”結構代表了受體不可結合狀態(tài)，而“向上(up)”結構則代表了受體可結合狀態(tài)，但同時“向上”結構較為不穩(wěn)定。

　　圖B為不同角度新冠病毒S蛋白圖像，RBD“向上”原聚體以帶狀顯示，顏色與圖A相對應(綠色)

　　利用已經公開的新冠病毒序列的(上圖A)，作者們通過親和層析和凝膠排阻層析進行體外蛋白純化，利用冷凍電鏡技術初步篩選顯示出高顆粒密度的新冠病毒S蛋白圖像。

　　通過收集和分析3207份蛋白顯微影像后，作者們對蛋白進行了3D結構重組，重建了一個3.5 分辨率的不對稱三聚體圖像，其中一個RBD存在于“向上”結構中(上圖B)。

　　研究團隊通過使用3D可變性功能觀察到了RBD類似鉸鏈的運動，值得注意的是，這種看似隨機的RBD運動已在與新冠病毒密切相關的乙型冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV(中東呼吸綜合征冠狀病毒)中被觀察到，同時在與其親屬關系遠一些的的甲型冠狀病毒：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的結構表征中也被捕獲到。

　　新冠病毒為什么傳染性更強

　　作者們將新冠病毒的結構與其他幾種冠狀病毒進行了比較。2019-nCoV的S蛋白整體結構與SARS病毒S蛋白的整體結構相似，各個結構之間具有高度同源性，它們之間最大的差異是RBD在其各自的“向下”結構中的位置差異。

　　作者們發(fā)現，與SARS病毒相比，新型冠狀病毒中的RBD結構更靠近三聚體的中央部位，處于“向下”構象的SARS-CoV的RBD則與相鄰原聚體的N末端域(NTD)緊貼著。

　　其S蛋白中3個RBD中的1個會向上螺旋突出，導致S1亞基的脫落和S2的折疊，從而使S蛋白更容易與宿主受體血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合。

　　另外，先前有報道發(fā)現新型冠狀病毒與SARS病毒共享形同的宿主細胞受體ACE2，作者們希望進行動力學方面的檢測以進一步確認兩者之間的不同。

　　最近的報道表明，2019-nCoV的S蛋白和SARS-CoV的S蛋白有著相同的功能宿主細胞受體-血管緊張素轉換酶2(ACE2)，作者們通過表面等離子共振(SPR)的動力學手段量化了病毒與該受體的相互作用。

　　令人驚訝的是，通過表面等離子共振技術(SPR)分析得到的結果顯示，新冠病毒S蛋白與ACE2的平衡解離常數KD是15 nM，而SARS病毒S蛋白與ACE2的平衡解離常數KD達到了325.8 nM。KD值越大意味解離越多，S蛋白與ACE2的親和力越弱。

　　經過計算，新冠病毒S蛋白與ACE2的親和力，是SARS病毒S蛋白與ACE2之間親和力10倍，甚至20倍。

　　因此，研究團隊認為，可能正是新型冠狀病毒S蛋白與ACE2的高親和力，讓新冠肺炎在人與人之間傳播變得容易。當然，還需要進一步研究確認這個結論。

　　研究團隊還形成了與新冠病毒的S蛋白胞外域結合的ACE2的復合物(上圖B)，并通過高分辨率冷凍電鏡觀察到，它與SARS-CoV的S蛋白和ACE2之間形成的復合物非常相似。

　　新型冠狀病毒病毒對于ACE2具有高親和性

　　這也說明，新型冠狀病毒侵入宿主的機制雖然與其他的冠狀病毒科的病毒相似，但傳染性更強。

　　新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13

　　除了SARS病毒之外，新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13在S蛋白中序列同源性高達96%。但新型冠狀病毒S蛋白最顯著的不同是，其具有S1/S2蛋白酶切割位點的“RRAR”(弗林蛋白酶識別位點)氨基酸序列，而不是像SARS病毒中僅具有單個精氨酸。

　　新冠病毒的這一現象在流感病毒中較為普遍，其中高毒力禽流感病毒和人流感病毒常發(fā)生流感血凝素蛋白的關鍵位置上產生多聚弗林蛋白酶位點的氨基酸插入。

　　除了在S1/S2連接處的氨基酸殘基差異外，新型冠狀病毒和RaTG13病毒的S蛋白還存在29個氨基酸殘基的差異，其中17個位于受體結合的RBD部位。

　　團隊還分析了全球共享禽流感數據倡議組織(GISAID)數據庫中的61個新冠病毒的S序列，發(fā)現在所有保存的序列中只有9個氨基酸取代。這些取代中的大多數相對保守，預計不會對新冠病毒的S蛋白結構或功能產生重大影響。

　　抗體實驗

　　由于新型冠狀病毒與SARS病毒之間的結構同源性且共用受體，作者們希望對已經發(fā)表的SARS病毒的RBD定向單克隆抗體(mAb)對新型冠狀病毒的RBD進行交叉反應性測試。

　　作者們通過BLI檢測試劑盒評估了SARS-CoV RBD的定向單克隆抗體S230、m396和80R的交叉反應性。

　　S230、m396和80R對于新冠病毒沒有明顯結合

　　但是作者們發(fā)現，盡管兩病毒RBD之間結構高度相似，但是三種SARS病毒的RBD抗體在所測試的濃度(1μM)下，均未檢測到與新冠病毒的RBD的結合。

　　研究者們認為，盡管這三種抗體的表位僅占新冠病毒的RBD表面積的一小部分，但由于觀察不到結合，可以認為針對SARS病毒的的抗體對新冠病毒不一定具有交叉反應性，但新型冠狀病毒S蛋白作為未來抗體分離與治療方案的設計將提供重要參考。